HEPENGBIO 食物总抗氧化能力（TAC）荧光法（ORAC）定量检测试剂盒
产品说明书
主要用途
HEPENGBIO 食物总抗氧化能力（TAC）荧光法（ORAC）定量检测试剂是一种旨在通过使用荧光素探针， 受到有机氮自由基 AAPH 的破坏，但在抗氧化剂的存在下，得到抑制，由此通过荧光分光光度仪，观察其峰值下降程度的变化，来定量检测对应于标准水溶性生育酚Trolox 的总抗氧化能力，即消除自由基等值浓度的方法。适用于各种新鲜食物样品总抗氧化能力检测。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定。
技术背景
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基
（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内，通过抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、铜蓝蛋白（ceruloplasmin；CER）、铁蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素
（bilirubin）等，产生抗氧化能力，即捕获自由基的能力，达到消除或降低ROS的损害。通过氧自由基吸光能力（oxygen radical absorbance capacity；ORAC），即使用荧光素（fluorescein）作为探针，2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（2,2-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride；AAPH）作为过氧自由基供体（peroxyl radical donor），其攻击探针，产生荧光淬灭，一旦受到抗氧化剂作用，而防止荧光消失，由此评价抗氧化潜力和活性，也就是自由基去除作用（free radical scavenging），在荧光分光光度仪（激发波长485nm±20，散发波长528nm±20）的帮助下，观察其峰值下降程度的变化，并与标准化抗氧化剂水溶性生育酚Trolox对照。
产品内容
HEPENGBIO 清理液（Reagent A） 500 毫升
HEPENGBIO 缓冲液（Reagent B） 4 毫升
HEPENGBIO 染色液（Reagent C） 7.5 毫升
HEPENGBIO 氧化液（Reagent D） 1 管
HEPENGBIO 标准液（Reagent E） 200微升
产品说明书 1 份
保存方式
保存 HEPENGBIO 清理液（Reagent A）和 HEPENGBIO 缓冲液（Reagent B）在 4℃冰箱里，其余的保存在
－20℃冰箱里，避免光照；有效保证 6 月
用户自备
50 毫升烧杯：用于样品操作的容器
15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5 毫升离心管：用于标准样品配制的容器
4℃台式离心机：用于样品操作
200 微升 1 厘米光径比色皿或黑色 96 孔板：用于荧光分析的容器荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析
实验步骤
一、 样品准备
1、固态食品处理
1. 秤取 1 克固态食品或粉末到 50 毫升烧杯，杯口封口膜密封
2. 加入 8 毫升
HEPENGBIO 清理液（Reagent A）
3. 搅拌 30 分钟，充分混匀
4. 继续加入
HEPENGBIO 清理液（Reagent A）到终容量为 10 毫升
5. 过滤纸过滤，去除不溶性固体颗粒
6. 封口膜封口备用
2、液态食品处理
1. 移取 5 毫升待测液态食品到 15 毫升锥形离心管
2. 放进台式离心机离心 10 分钟，速度为 1500g
3. 移取上清液到新的 15 毫升锥形离心管
4. （选择步骤）可以加入适量的
HEPENGBIO 清理液（Reagent A）
5. （选择步骤）过滤纸过滤（如果离心处理，样品仍然不清澈）
6. 置于冰槽里备用或放进-20 冰箱里保存
二、标准液准备
1. 准备好 5 个 1.5 毫升离心管，标记为 1 至 5 号管
2. 分别加入 50 微升
HEPENGBIO 缓冲液（Reagent B）到 2 至 5 号管
3. 移取 100 微升
HEPENGBIO 标准液（Reagent E）到 1 号管，混匀
4. 小心移取 50 微升 1 号管的
HEPENGBIO 标准液（Reagent E）到 2 号管，混匀
5. 小心移取 50 微升 2 号管稀释的
HEPENGBIO 标准液（Reagent E）到 3 号管，混匀
6. 小心移取 50微升 3 号管稀释的
HEPENGBIO 标准液（Reagent E）到 4 号管，混匀
7. 将 1 至 5 号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
| 管号 |
HEPENGBIO 缓冲液（Reagent B） |
HEPENGBIO 标准液（Reagent
E） |
测定体系
标准 Trolox 浓度 |
| 1 |
0 |
100 微升 |
1微摩尔/升 |
| 2 |
50 微升 |
50 微升 |
0.5 微摩尔/升 |
| 3 |
50 微升 |
50 微升 |
0.25 微摩尔/升 |
| 4 |
50微升 |
50 微升 |
0.125 微摩尔/升 |
| 5 |
50微升 |
0 |
0 |
三、 样品测读
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化，移取 1.5 毫升
HEPENGBIO 缓冲液（Reagent B） 到 1 管
HEPENGBIO 氧化液（Reagent D）里，混匀，置于暗室里，标记为
HEPENGBIO 氧化工作液，避免光照。然后进行下列操作。
1. 准备 1 个黑色 96 孔板，做好标记：最大对照孔、标准样品孔、待测样品孔
2. 分别移取 150 微升
HEPENGBIO 染色液（Reagent C）到黑色 96 孔板里的每个孔里
3. 加入 25 微升
HEPENGBIO 缓冲液（Reagent B）到最大对照孔
4. 加入 25 微升上述配制的
HEPENGBIO 标准液（Reagent E）到相应标准样品孔里
5. 加入 25 微升样品（100 微克食品总量）到待测样品孔里
6. 放进 37℃培养箱里孵育 30 分钟
7. 分别加入 25 微升
HEPENGBIO 氧化工作液到标准样品孔和待测样品孔里
8. 加入 25 微升
HEPENGBIO 缓冲液（Reagent B）到最大对照孔
9. 轻轻摇动黑色 96 孔板，使其混匀
10. 放进 37℃培养箱里孵育 15 分钟
11. 即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪里测读：激发波长 485nm±20，散发波长 528nm±20，增益倍数25至100
12. 分析结果：
1. 构建标准曲线：纵坐标(Y轴）为荧光单位;横坐标（X轴）为标准Trolox浓度（微摩尔/升）
2. 最大对照孔为最大荧光单位读数
3. 标准样品孔和待测样本孔为实际荧光单位读数
4. 根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度（微摩尔/升）
5. 计算样品实际总抗氧化能力
【根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度（微摩尔/升）X0.2（体系容量;毫升）X样品稀释倍数】÷0.025（样品容量;毫升）=（微摩尔/升Trolox等值）
6. 根据下列公式计算测定体系中样品量的总抗氧化能力（实际抑制百分率）
【实际荧光单位读数÷最大对照孔荧光单位读数】X100%
7. IC50:50%抑制率所需的样品单位：Trolox 等值（微摩尔/升）或样品重量（毫克/毫升）或样品容量（微升）
X(所需样品单位）=（已知样品单位÷实际抑制百分率）X50%
注意事项
1. 本产品为 50 次操作，包括标准品
2. 本产品测试范围为 100 纳摩尔至 1 微摩尔 Trolox 等值
3. 操作时，须戴手套
4. 样品制备的所有操作均须在 4℃状态下进行
5. 建议复孔操作
6. 用户可以调整标准曲线区间,尤其出现标准5号管读数大于4号管读数时
7. 测试前，样品须新鲜收集
8. 样品须清澈
9. 样品读数越高，下降程度越小，抗氧化能力越高
10. 可以使用比色皿检测
11. 如果样品抗氧化剂浓度过高或过低， 建议稀释或增加样品容量或浓度
12. 如果测试样品很多，建议使用排枪移液
13. 本公司提供系列抗氧化分析试剂产品
