组织糖原磷酸化酶 a 活性酶连续循环比色法定量检测试剂盒-技术资料/价格-赫澎上海生物

HEPENGBIO 组织糖原磷酸化酶 a 活性酶连续循环比色法定量检测试剂盒
产品说明书
 
主要用途
 
HEPENGBIO 组织糖原磷酸化酶 a 活性酶连续循环比色法定量检测试剂是一种旨在通过糖原磷酸化酶 a 、 磷酸葡萄糖变位酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶连续反应系统中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP) 还原后峰值的增高，即采用比色法来测定组织裂解萃取样品中酶活性的方法。其适用于各种组织裂解萃取悬液样品 (动物、人体、 昆虫等) 糖原磷酸化 酶 a 的特异活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
 
糖原磷酸化酶 (glycogen phosphorylase；EC2.4. 1. 1) 是磷酸化酶家属之一，在机体糖原分解 (glycogenolysis ) 利用上发挥重要作用。其结构为同源双体，有两种组合形式：紧密型 (tense) 和松弛型 (relaxed) 。处于紧 密型的酶与糖原结合，增强活性。未经修饰的酶 (糖原磷酸化酶b) 催化产生足够的葡萄糖- 1-磷酸，进入  糖酵解循环，生成ATP 。糖原磷酸化酶催化糖原上α  (1→4) 糖苷链 (glycosidic linkage) 的磷酸分解       (phosphorolytic cleavage) 反应，释放葡萄糖- 1-磷酸产物。糖原磷酸化酶在肝组织、肌肉组织和脑组织中 有不同类型的异构体。糖原磷酸化酶分为a型和b型：a型为活化状态，而b型为非活化状态，在单磷酸腺苷  (AMP) 的激活下，转化为a型。糖原磷酸化酶的缺失将导致肌肉营养不良症 (McArdle综合征) 和肝磷酸 化酶缺乏症 (Hers病) 。基于底物糖原 (glycogen)，在糖原磷酸化酶无需AMP激活剂的存在， 由糖原磷酸 化酶a催化其分解并产生葡萄糖- 1-磷酸 ( α-D-Glucose- 1-Phosphate ) 产物后，通过磷酸葡萄糖变位酶        (phosphoglucomutase；PGLUM) 和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (glucose-6-phosphate dehydrogenase；G-6-PDH) 反应系统，测定氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP) (oxidized nicotinamide adenine dinucleotide        phosphate ；NADP) 转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (reduced nicotinamide adenine dinucleotide               phosphate ；NADPH) 所产生的吸光峰值的变化 (340nm  波长) ，来定量分析糖原磷酸化酶a 的特异活性。 糖原磷酸化酶a酶连续循环反应系统为：
 
glycogen phosphorylase a
(glycogen) n       +    Pi               →       (glycogen) n－1    +    α-D-Glucose- 1-Phosphate
 
phosphoglucomutase
α-D-Glucose- 1-Phosphate                   →     α-D-Glucose-6-Phosphate
 
glucose-6-phosphate dehydrogenase
α-D-Glucose-6-Phosphate    +    β-NADP    →  6-Phosphogluconate      +    β-NADPH
(低吸收峰)                               (高吸收峰)
 
产品内容

HEPENGBIO 清理液 (Reagent A)                                          30 毫升
HEPENGBIO 裂解液 (Reagent B)                                           6 毫升
HEPENGBIO 缓冲液 (Reagent C)                                          10 毫升
HEPENGBIO 底色液 (Reagent D)                                           1 毫升
HEPENGBIO 反应液 (Reagent E)                                           1 毫升
HEPENGBIO 阴性液 (Reagent F)                                         500 微升
产品说明书                                                            1 份
 
保存方式
 
保存 HEPENGBIO 缓冲液 (Reagent C)、HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 和 HEPENGBIO 反应液  (Reagent E) 在－20℃冰箱里；  其余的保存在 4℃冰箱里，HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 和     HEPENGBIO 反应液 (Reagent E) 避免光照；有效保证 6 月
 
用户自备
 
1.5 毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
15 毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
(微型) 台式离心机：用于样品制备
比色皿或 96 孔板：用于比色的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
 
实验步骤
 
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的 HEPENGBIO 裂解液 (Reagent B) 置入冰槽里融化。然后 进行下列操作。
 
一、  样品准备
 
1 ．  手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量
2 ．   (选择步骤) 放进预冷的 15 毫升锥形离心管
3 ．   (选择步骤) 加入适量的 (500 毫克组织需要 3 毫升) HEPENGBIO 清理液 (Reagent A) 清洗 1 次
4 ．  移入到一个液氮冻存管
5 ．  即刻放进液氮罐过夜
6 ．  次日从液氮罐里取出，即刻 (最快速度) 用研磨棒碾碎组织成粉末状 (注意：切莫使组织冻融)
7 ．  放进一个 15 毫升锥形离心管
8 ．  加入置于冰槽里的 500 微升 HEPENGBIO 裂解液 (Reagent B)
9 ．  转移到 1.5 毫升离心管
10．强力涡旋震荡 30 秒，充分混匀
11．放进冰槽里孵育30 分钟，期间每 10 分钟强力涡旋震荡 30 秒 (注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱 里储存备用)
12．即刻放进 4℃微型台式离心机离心 10 分钟，速度为 16000g   (或 13000RPM。例如 EPPENDORF 5415)
13．小心移取上清液到新的 1.5 毫升离心管
14．移取 10 微升进行蛋白定量检测 (注意：建议使用HEPENGBIO Bradford  蛋白质浓度定量试剂盒

)
15．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
二、  测定准备
 
1 ．  开启并设定好分光光度仪 (温度为 30℃)：波长 340nm ，间隔 60 秒，读数 6 次 (共 5 分钟)，并置零
2 ．  从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 避免光照
3 ．  HEPENGBIO 缓冲液 (Reagent C) 室温下均衡温度
 
三、  背景对照测定
 
1 ．  移取 780 微升 HEPENGBIO 缓冲液 (Reagent C) 到新的比色皿
2 ．  加入 100 微升 HEPENGBIO 底色液 (Reagent D)
4 ．  加入 100 微升 HEPENGBIO 反应液 (Reagent E)
5 ．  上下倾倒数次，混匀
6 ．  在 30℃温度下孵育 3 分钟
7 ．  加入 20 微升 HEPENGBIO 阴性液 (Reagent F)
8 ．  上下倾倒数次，混匀 (限定在 3 秒之内)
9 ．  即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照 (5 分钟读数－0 分钟读数)
 
四、  样品测定
 
1 ．  移取 780 微升 HEPENGBIO 缓冲液 (Reagent C) 到新的比色皿
2 ．  加入 100 微升 HEPENGBIO 底色液 (Reagent D)
3 ．  加入 100 微升 HEPENGBIO 反应液 (Reagent E)
4 ．  上下倾倒数次，混匀
5 ．  在 30℃温度下孵育 3 分钟
6 ．  加入 20 微升待测样品 (100 微克蛋白) (注意：样品须清澈，且pH  为6.8)
7 ．  上下倾倒数次，混匀 (限定在 3 秒之内)
8 ．  即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数 (5 分钟读数－0 分钟读数)
 
五、  计算样品活性
 
[  (样品读数－背景读数) X 1  (体系容量；毫升) X 样品稀释倍数]÷ [0.02  (样品容量；毫升) X 6.22  (毫摩 尔吸光系数) X 5  (反应时间；分钟) ] ＝单位/毫升÷  (样品蛋白浓度) 毫克/毫升＝单位/毫克
 
单位＝微摩尔 NADP/分钟
 
六、  酶标仪测定
 
1 ．  在 96 孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2 ．  分别移取 195 微升 HEPENGBIO 缓冲液 (Reagent C) 到所有孔里
3 ．  分别加入 25 微升 HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 到所有孔里
4 ．  分别加入 25 微升 HEPENGBIO 反应液 (Reagent E) 到所有孔里
5 ．  轻轻摇动 96 孔板

6 ．  在 30℃温度下孵育 3 分钟
7 ．  分别加入 5 微升 HEPENGBIO 阴性液 (Reagent F) 或待测样品 (100 微克蛋白) (注意：样品须清 澈，且pH  为6.8) 到相应孔里
8 ．  轻轻摇动 96 孔板
9 ．  即刻放进酶标仪检测，包括 0 分钟读数和 5 分钟读数)
10．活性计算
 
[  (样品读数－背景读数) X 样品稀释倍数 X 0.25  (体系容量；毫升) ]÷ [0.005  (样品容量；毫升) X 6.22  (毫摩尔吸光系数) X 0.6  (光径距离；厘米) X 5  (反应时间；分钟) ] ＝单位/毫升÷  (样品蛋白浓度) 毫 克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔 NADP/分钟
 
注意事项
 
1 ．  本产品为 10 次 (比色皿) 和 40 次 (酶标仪) 操作，包括背景对照
2 ．  操作时，须戴手套
3 ．  系统操作过程中，背景测定只需 1 次
4 ．  建议使用比色皿测定
5 ．  样品须澄清，至关重要
6 ．  加样后3 秒内比色测定
7 ．  测定值由低到高变化；测定可持续 5 分钟
8 ．  比色测定后，比色皿须清洗彻底
9 ．  样本测定 5 分钟读数高于 0 分钟读数表明具有酶活性
10．建议待测样本蛋白浓度为 100 微克/20 微升；如果样本酶活性过低或过高，  则可以增加或降低样本量 (本公司提供  Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－ )
11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
12．糖原磷酸化酶 a 单位活性定义为：在 30℃，pH 6.8 条件下，每分钟内能够转化 1 微摩尔糖原和正磷酸 (orthophosphate ) 至葡萄糖- 1-磷酸所需的酶量作为一个活性单位
13．本公司提供系列细胞磷酸化酶学检测试剂产品
 
质量标准
 
1 ．  本产品经鉴定性能稳定
2 ．  本产品经鉴定检测敏感