细胞醛糖还原酶（aldose reductase；AR）活性光度法定量检测试剂盒-技术资料/价格-赫澎上海生物

细胞醛糖还原酶（aldose reductase；AR）活性光度法定量检测试剂盒
产品说明书
主要用途
HEPENGBIO细胞醛糖还原酶（aldose reductase；AR）活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过底物葡糖醛酸，在醛糖还原酶的催化作用下，产生山梨醇，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用光度法来测定样品中酶活性的方法。其适用于各种细胞（动物、人体、昆虫等）裂解悬液样品醛糖还原酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
醛糖还原酶（aldose reductase；ALR2，EC1.1.1.21）是一种NADPH依赖性氧化还原酶，属于醛酮还原酶（aldo-keto reductase；AKR）超级家族成员之一，催化各种醛类和羰基化合物的还原反应，特别是葡萄糖还原为山梨醇的反应，是葡萄糖代谢中多元醇（polyols）通路的第一步反应的关键限速酶。醛糖还原酶主要在人体肝组织、晶状体、视网膜、雪旺氏细胞、胎盘组织和红细胞中表达。醛糖还原酶与糖尿病并发症相关，包括白内障、神经病变、肾脏病变、视网膜病变、动脉粥样硬化等，由此成为药物靶标。基于底物葡糖醛酸（glucuronate），在醛糖还原酶的催化作用下，产生山梨醇（sorbitol），同时其辅酶因子还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADPH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADP），通过测定吸光值的变化（340nm 波长），来定量分析醛糖还原酶的活性。其反应系统为：
 
    ALR2
Glucuronate  +  β-NADPH  →   sorbitol  +  β-NADP  
 
产品内容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 120毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B）  10毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）  20毫升
HEPENGBIO反应液（Reagent D）   2毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent E）   2毫升
HEPENGBIO阴性液（Reagent F）  500微升
产品说明书      1份
 
保存方式
 
保存在－20℃冰箱里；HEPENGBIO反应液（Reagent D）和HEPENGBIO底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月
 
 
用户自备
 
1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
（微型）台式离心机：用于样品操作
比色皿或96孔板：用于光度的容器
分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析
 
实验步骤
 
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
 
一、 样品准备
 
1． 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
2． 小心加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入500微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混匀
10． 转移到预冷的1.5毫升离心管
11． 强力涡旋震荡15秒
12． 置于冰槽里孵育30分钟
13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
 
二、 测定准备
 
1． 开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长340nm，间隔2分钟，读数6次（共10分钟），并置零
2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；HEPENGBIO底物液（Reagent E）避免光照
3． HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
 
三、 背景对照测定
 
1． 移取750微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入100微升HEPENGBIO反应液（Reagent D）
3． 加入100微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 在25℃温度下孵育3分钟
6． 加入50微升HEPENGBIO阴性液（Reagent F）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0分钟读数－10分钟读数）
 
四、 样品测定
 
1． 移取750微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入100微升HEPENGBIO反应液（Reagent D）
3． 加入100微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 在25℃温度下孵育3分钟
6． 加入50微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0分钟读数－10分钟读数）
 
五、计算样品活性
 
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 1（体系容量；毫升）]÷[0.05（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 1（光径距离；厘米）X 10（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克 
 
单位＝微摩尔NADPH/分钟
 
六、 酶标仪测定
 
1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2． 分别移取150微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到96孔板里
3． 分别加入20微升HEPENGBIO反应液（Reagent D）
4． 分别加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
5． 轻轻摇动96孔板
6． 在25℃温度下孵育3分钟
7． 分别加入10微升HEPENGBIO阴性液（Reagent F）或待测样品（50微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
8． 轻轻摇动96孔板
9． 即刻放进酶标仪检测：获得0分钟和10分钟读数
10． 活性计算
 
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.20（体系容量；毫升）]÷[0.01（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 10（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克 
 
单位＝微摩尔NADPH/分钟
 
注意事项
 
1． 本产品为20次（比色皿）和100次（96孔板）操作，包括背景对照
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，背景测定只需1次
4． 样品须澄清，至关重要 
5． 孵育完成后即刻光度测定
6． 测定值由高到低变化；测定持续10分钟
7． 样本测定10分钟读数低于0分钟读数表明具有酶活性
8． 光度测定后，比色皿须清洗彻底
9． 建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
10． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
11． 醛糖还原酶单位活性定义为：在25℃，pH 6.2条件下，每分钟内能够转化1微摩尔葡糖醛酸至山梨醇所需的酶量作为一个活性单位
12． 本公司提供系列医学生化经典分析试剂产品
 
质量标准
 
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感