非蛋白质巯基含量检测试剂盒说明书-可见分光光度法

非蛋白质巯基含量检测试剂盒说明书   可见分光光度法
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
规格：50T/24S
产品内容：
提取液一：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。
提取液二：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 5mL 无水甲醇充分溶解备用。
标准品：粉剂×1 支，10mg半胱氨酸，4℃保存。临用前加入 1.65mL 提取液溶解为 50µmol/ml 的半胱氨酸标准溶液。
提取液的配制：将提取液一和提取液二按体积比 1：1 的比例混合配制，按照样本数量配制并在当天用完。
产品说明：
生物体内巯基主要包括非蛋白质巯基和蛋白质巯基。巯基化合物在体内具有重要的解毒功能， 对生物体的自我调节具有非常重要的生理意义。
巯基基团与 5,5’- 二硫代-双-硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色化合物，在 412nm 处有最大吸收峰。
自备实验用品：
可见分光光度计、离心机、恒温水浴锅、1mL 玻璃比色皿、甲醇、研钵/匀浆器和蒸馏水。
操作步骤：
一、样品的制备
1、 动物、植物组织：称取约 0.1g，加入 1mL 的提取液，制备成 10%的匀浆，10000g，常温离心
10min，取上清待测。
2、   细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL  提取液），超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）然后 10000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
3、   血清（浆），培养液：向 0.1mL 血清（浆）或培养液中加入 1mL 提取液，10000g，常温离心10min，取上清待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。
2、将 50µmol/mL 标准溶液用提取液稀释至 0.3、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125µmol/mL 的标准液，现用现配。
3、操作表
 
对照管
测定管
标准管
空白管
上清液（mL）
0.3
0.3
-
-
标准品（mL）
-
-
0.3
-
试剂一（mL）
0.65
0.65
0.65
0.65
试剂二（mL）
-
0.1
0.1
-
H2O（mL）
0.1
 
 
0.4
混匀，室温放置 10min，测定 412nm 吸光值，分别记为 A 对照、A 测定、
A 标准、A 空白，计算∆A 测定=A 测定-A 对照，算∆A 标准=A 标准-A 空白。
三、计算公式
1、 标准曲线的绘制：
以标准液浓度为 x 轴，∆A 标准为 y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y=kx+b，将∆A 测定代入公式得到 x（µmol/mL）
2、 非蛋白质巯基含量计算：
（1） 按样本鲜重计算：
非蛋白质巯基含量（µmol/g 鲜重）=x×V 提取÷W=x÷W
（2） 按血清、培养液体积计算：
非蛋白质巯基含量（µmol/mL）=x×（V 提取+V 液体）÷V 液体=1.1×x。
（3） 按细胞数量计算：
非蛋白质巯基含量（µmol/104 cell）=x×V 提取÷500=0.002×x。
V 提取：加入提取液体积，1mL；W：样品质量，g；Cpr，样本蛋白浓度，mg/ml；500：500 万个细胞；V 液体：血清（浆）或培养液体积，0.1mL。
注意事项：
1、当吸光值大于 1.2 时，建议将上清液用提取液稀释后测定；吸光值过小时，建议提高样品质量或体积进行测定。