端粒重复序列扩增方法（telomeric repeat amplification protocol；TRAP）是基于多聚酶联扩增的敏感高效的体外端粒酶活性的检测。首先，非端粒单核苷酸引物作为端粒酶的底物而持续延长产生六碱基差异的片段；然后，延长所获得的产物在非端粒单核苷酸引物和逆向引物的参与下进行特异性扩增；内参引物的整合用于定量酶活性。银染可以检测25至50皮克DNA条带。
 
产品内容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO反应液（Reagent C）      毫升
HEPENGBIO上样液（Reagent D）      微升
HEPENGBIO胶底液（Reagent E） 毫升
HEPENGBIO凝结液（Reagent F） 毫升
HEPENGBIO促进液（Reagent G） 微升
HEPENGBIO胶体液（Reagent H） 毫升
HEPENGBIO电泳液（Reagent I） 毫升
HEPENGBIO固定液A（Reagent J）      毫升
HEPENGBIO固定液B（Reagent K）      毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent L） 毫升
HEPENGBIO中和液（Reagent M） 毫升
HEPENGBIO显影液A（Reagent N） 微升
HEPENGBIO显影液B（Reagent O） 微升
HEPENGBIO终止液（Reagent P） 毫升
产品说明书     1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）、HEPENGBIO裂解液（Reagent B）、HEPENGBIO反应液（Reagent C）和HEPENGBIO凝结液（Reagent F）在－20℃冰箱里，HEPENGBIO上样液（Reagent D）和HEPENGBIO促进液（Reagent G）保存在4℃冰箱里；其余的保存在室温下。HEPENGBIO上样液（Reagent D）、HEPENGBIO胶底液（Reagent E）、HEPENGBIO促进液（Reagent G）、HEPENGBIO胶体液（Reagent H）和HEPENGBIO染色液（Reagent L），避免光照，有效保证6月
 
用户自备
 
无离子水：用于染色使用的浓缩试剂
200毫升烧杯：用于配制工作液的容器
1.5毫升离心管：用于细胞裂解的容器
0.5毫升PCR管：用于扩增反应的容器
15毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制的容器
50毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制和溶液混匀的容器
PCR仪：用于扩增反应物
微型台式离心机：用于沉淀反应物
电泳仪：用于TRAP分子电泳分离
平式摇荡仪：用于染色反应
染色塑料盒：用于PAGE凝胶染色的容器
自动成像仪或PHOSPHORIMAGE：用于电泳染色记录
 
实验步骤
 
一、 样品制备
 
1． 准备1个细胞培养6孔板的单孔细胞，直至生长至80％铺满率（1 X 10⁵细胞）
2． 小心抽去细胞培养液
3． 加入xx毫升预冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
4． 小心移去清理液
5． 用细胞刮脱棒刮落细胞转移到1.5毫升离心管
6． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
7． 小心抽去上清液
8． 小心加入xx微升预冷的HEPENGBIO裂解液（Reagent B），混匀细胞颗粒群
9． 放进冰槽里孵育30分钟
10． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）
11． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）
12． 即刻放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里备用
 
二、 扩增反应
 
1． 准备2个0.5毫升PCR管，置于冰槽里
2． 按照下表依次加入反应物

内容物	样品管	阴性对照管
HEPENGBIO反应液（Reagent C）	xx微升	xx微升
细胞裂解悬液样品	2微升（200纳克细胞总蛋白）	――
HEPENGBIO裂解液（Reagent B）	――	xx微升
总量	50微升	50微升

 
3． 混匀
4． 室温下（30℃）孵育30分钟
5． 即刻放进PCR仪，按照下表扩增
 

反应温度（℃）	反应时间	反应循环
94	90秒	1
94	30秒	30至34
60	30秒
72	60秒

 
6． 分别加入xx微升HEPENGBIO上样液（Reagent D）
7． 置入冰槽里等待上样
 
三、 垂直电泳分析
 
实验开始前，将HEPENGBIO胶底液（Reagent E）、HEPENGBIO凝结液（Reagent F）、HEPENGBIO促进液（Reagent G）和HEPENGBIO胶体液（Reagent H）放进37℃恒温水槽预热。然后进行下列操作。
 
1． 移出xx毫升HEPENGBIO胶底液（Reagent E）到15毫升锥形离心管里
2． 加入xx微升HEPENGBIO凝结液（Reagent F）
3． 加入xx微升HEPENGBIO促进液（Reagent G）
4． 混匀后，即刻移入玻璃槽，避免气泡
5． 在室温下孵育45分钟，或直至胶体凝结
6． 移出xx毫升HEPENGBIO胶体液（Reagent H）到50毫升锥形离心管里
7． 加入xx微升HEPENGBIO凝结液（Reagent F）
8． 加入xx微升HEPENGBIO促进液（Reagent G）
9． 混匀后，即刻移入玻璃槽，避免气泡
10． 插入10孔梳
11． 在室温下孵育45分钟，或直至胶体凝结
12． 移取xx毫升HEPENGBIO电泳液（Reagent I）到500毫升容器里，加入450毫升无离子水，混匀后，标记为HEPENGBIO电泳工作液
13． 加入适量的HEPENGBIO电泳工作液到电泳槽里
14． 在4℃环境下预运行15分钟，电压为150伏
15． 上样：25微升（注意：使用20碱基的DNA marker）
16． 继续4℃环境下电泳2小时，电压为150伏，或直至溴酚蓝（Bromophenol Blue）染料移动到胶体三分之二处
17． 拆除电泳装置，取出电泳玻璃板块（注意：胶体脆弱）
18． 分离玻璃板快，切除胶底
19． 将胶体放进染色塑料盒里
 
 
 
四、 染色处理
 
1． 小心加入xx毫升HEPENGBIO固定液A（Reagent J）到上述塑料盒里
2． 小心加入xx毫升HEPENGBIO固定液B（Reagent K），混匀
3． 置于平式震荡仪上，在室温下孵育30分钟，速度为50RPM
4． 小心倒去固定液
5． 小心加入80毫升用户自备的无离子水
6． 小心加入xx毫升HEPENGBIO染色液（Reagent L）
7． 置于平式震荡仪上，在室温下孵育30分钟，速度为50RPM，避免光照
8． 小心倒去HEPENGBIO染色液（Reagent L）
9． 小心加入100毫升用户自备的无离子水
10． 置于平式震荡仪上，在室温下孵育1分钟，速度为50RPM
11． 小心倒去无离子水
12． 准备1个200毫升烧杯
13． 加入80毫升用户自备的无离子水
14． 加入xx毫升HEPENGBIO中和液（Reagent M）
15． 加入xx微升HEPENGBIO显影液A（Reagent N）
16． 加入xx微升HEPENGBIO显影液B（Reagent O），混匀
17． 小心倒入塑料盒里
18． 置于平式震荡仪上，在室温下孵育6分钟，速度为50RPM（注意：可见金黄色条带；避免过度染色）
19． 小心倒去显影液
20． 小心加入80毫升用户自备的无离子水
21． 小心加入xx毫升HEPENGBIO终止液（Reagent P），混匀
22． 置于平式震荡仪上，在室温下孵育30分钟，速度为50RPM（注意：可以保存在终止液里）
23． 小心取出胶体
24． 即刻置于自动成像仪上或PHOSPHORIMAGE下成像记录，并测算条带强度
25． 计算端粒酶活性：
 
所有阶梯条带强度累加之和÷内参条带强度＝相对TRAP活性   
 
注意事项
 
1． 本产品为10次操作（包括10次裂解、20次反应、2次电泳）
2． 整个操作过程，须戴手套
3． 必须使用带滤芯的枪头
4． 所有器皿、离心管、液体等无RNA酶污染
5． 建议使用裂解液作为阴性对照
6． 内参分子大小为36bp
7． 内参条带信号过弱，表明端粒酶活性过高，建议稀释或减少样品量；建议实验操作增加样品浓度梯度
8． 电泳前注意清洗样品孔
9． 电泳操作注意安全
10． 染色时，须在室温下操作，并避免光照；避免过度染色
11． 染色时间可以根据情况调整（参考图像如下：黑色箭头指示内参条带36碱基；括号区域表明六碱基相间的阳性条带，起始条带为50碱基）