肌肉组织细胞中含有氧化酶，包括细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶和NADH四氮唑兰还原酶（NADH-TR）等，通过组织化学染色，可以呈现低含量（阴性染色）和高含量（深度染色）线粒体状况，由此分辨肌纤维类型和识别线粒体肌病（myopathy）。细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）是氧化呼吸链的酶部分的总称。其存在于真核生物的细胞线粒体上，主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量。二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是人工电子供体染料，通过与金属蛋白，例如含铁蛋白细胞色素C中的物理性结合，产生非酶源性自然氧化，同时提供电子（细胞色素C作为电子受体）于呼吸链的电子传递系统，由此呈现出颜色变化和沉积，形成棕褐色不溶性产物。在DAB自然氧化的同时，产生活性氧，例如过氧化氢，由过氧化氢酶防止其聚集。在大量氧化型DAB的存在下，通过细胞色素氧化酶的作用，亚铁细胞色素C被氧化成正铁细胞色素C。由此氧化型DAB棕褐色不溶性产物被用于检测组织细胞中细胞色素氧化酶的活性。琥珀酸脱氢酶（succinnate dehydrogenase；SDH；EC 1.3.99.1）是三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle；TCA）或Krebs循环中与细胞线粒体膜相关的重要元素，位于线粒体内膜，参与细胞呼吸链。其功能在于催化琥珀酸（succinate）的氧化反应，产生延胡索酸（furmarate），通过黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide；FAD）传递电子。基于琥珀酸脱氢酶的反应原理，使用人工电子受体染料硝基蓝四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT），接受来自还原型黄素腺嘌呤二核苷酸（Reduced flavin Adenine Dinucleotide；FADH₂）的电子，而被还原，产生不溶性蓝色或蓝黑色甲暨色素。使用双酶染色，可以有效地筛选线粒体疾病和进行肌纤维分型。 
 
产品内容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）  XX毫升
HEPENGBIO染色液A1（Reagent B1）  XX毫升
HEPENGBIO染色液A2（Reagent B2）  XX管
HEPENGBIO反应液A（Reagent C）  XX微升
HEPENGBIO染色液B（Reagent D）  XX毫升
HEPENGBIO反应液B（Reagent E）  XX微升
HEPENGBIO固着液（Reagent F）  XX毫升
产品说明书    1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO染色液A和B（Reagent B和D）和HEPENGBIO反应液A和B（Reagent C和E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月
 
用户自备
 
1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器
培养箱：用于反应孵育
中性树脂：用于切片封片
光学显微镜：用于切片染色后观察分析
 
实验步骤
 
染色开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化；移取XX毫升HEPENGBIO染色液A1（Reagent B1）到XX管HEPENGBIO染色液A2（Reagent B2）里，混匀，标记为HEPENGBIO染色工作液，置于冰槽里备用，避免光照（注意：有效期1周）；继续移取XX微升HEPENGBIO染色工作液到新的1.5毫升离心管，加入100微升HEPENGBIO反应液A（Reagent C），混匀后，标记为HEPENGBIO反应工作液A，置于冰槽里，避免光照；同时移取XX微升HEPENGBIO染色液B（Reagent D）到新的1.5毫升离心管，加入XX微升HEPENGBIO反应液B（Reagent E），混匀后，标记为HEPENGBIO反应工作液B，置于冰槽里，避免光照。然后进行下列操作。
 
1． 取出待测的10微米厚的冰冻组织切片 
2． 小心加上XX微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）在切片上，铺满整个样品表面
3． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
4． 小心加上XX微升 HEPENGBIO反应工作液A，铺满整个切片样品表面
5． 放进37℃培养箱里孵育30分钟，避免光照
6． 小心移去切片上的HEPENGBIO反应工作液A
7． 小心加上XX微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）在切片上，铺满整个切片样品表面
8． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
9． 重复实验步骤7至8二次
10． 小心加上XX微升 HEPENGBIO反应工作液B，铺满整个切片样品表面
11． 放进37℃培养箱里孵育15分钟，避免光照
12． 小心移去切片上的HEPENGBIO反应工作液B
13． 小心加上XX微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）在切片上，铺满整个切片样品表面
14． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
15． 重复实验步骤13至14二次
16． 小心加上XX微升HEPENGBIO固着液（Reagent F）在切片上，铺满整个切片样品表面
17． 室温下孵育15分钟
18． 小心移去切片上的HEPENGBIO固着液（Reagent F）
19． 小心加上XX微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）在切片上，铺满整个切片样品表面
20． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
21． 重复实验步骤19至20二次
22． 放上盖玻片或封片（中性树脂）
23． 即刻在光学显微镜下观察和计数：
单纯表达细胞色素氧化酶活性的组织细胞，呈现棕色
单纯表达琥珀酸脱氢酶活性的组织细胞，呈现蓝色
同时表达细胞色素氧化酶和琥珀酸脱氢酶活性的组织细胞，呈现棕蓝色
 

肌纤维类型	COX染色	SDH染色	COX/SDH
Ⅰ	深棕色	深蓝色	深棕蓝色
ⅡA	中度棕色	中度蓝色	中度棕蓝色
ⅡB	浅棕色	浅蓝色	浅棕蓝色

 

状况	COX染色	SDH染色	COX/SDH
正常	棕色	蓝色	棕蓝色
异常	无色	无色	单棕色或单蓝色或全无色

 
注意事项
 
1． 本产品为20次操作
2． 建议使用异戊烷（isopentane）快速冷冻组织，避免切片冰晶形成
3． 冰冻切片不宜固定和包埋处理
4． 操作时，须戴手套
5． HEPENGBIO染色液和HEPENGBIO反应液避免反复冻融
6． HEPENGBIO染色工作液不宜久存，1周内使用为佳
7． 每次更换试剂溶液时，保持切片面基本晾干
8． 试剂溶液在切片表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满切片表面
9． 整个操作，在避光状态下进行
10． 染色完成后，即刻进行光学显微镜观察 
11． 样品染色后保存，避免光照
12． 细胞色素C氧化酶和琥珀酸脱氢酶双酶双酶染色参考图像： 
13． 本公司提供系列组织细胞酶活性染色试剂产品