蒂姆硫化法银染（Timm’s sulfide silver staining）是由蒂姆建立的用于观察脑组织和其它组织中（例如胰腺、小肠、睾丸、肾脏等）微量金属元素锌，以及其它重金属元素，例如铜、镍、钴和铁等的染色。主要用于观察中枢神经系统中含锌神经元，以及新轴突分枝（sprouted axon）和轴突终端（axon terminal）等结构，分析大脑灰质内部的海马中轴突终端（突触泡囊synaptic vesicle）、苔藓终端（齿状颗粒细胞dentate granule cells）中的反应性锌的分布，与突触活性和膜去极化的关系，研究神经退行性和癫痫病理性变化机制。其原理在于使用硫化物，与组织中的游离金属元素反应成为不溶性复合物沉积，进而在还原剂的作用下，金属硫化物催化还原离子银为可见金属银沉积，呈现黑色，此为金属自显影术（autometallography，AMG）。新型蒂姆硫化法银染（neo-TIMM）具有显示（visualization）改善的优点。
 
产品内容
 
HPBIO硫化液（Reagent A）  500毫升
HPBIO固着液（Reagent B）    500毫升
HPBIO清理液（Reagent C）  100毫升
HPBIO染色液A（Reagent D）       5  毫升
HPBIO染色液B（Reagent E）       100微升
产品说明书  1份
 
保存方式
 
保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保证3月
 
用户自备
 
PBS缓冲液：用于灌注
无离子水：用于组织清洗
1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器
无菌镊子：用于转移动物脑组织
小型玻璃染色缸：用于组织或切片处理的容器
切片机：用于组织切片
明胶化载玻片和盖玻片：用于切片后铺片
中性树脂：用于切片封片
光学显微镜：用于切片染色后观察分析
 
实验步骤
 
一、 样本固着处理
 
1． 常规麻醉动物和手术（建议：使用用户自备的4℃预冷的PBS由心脏处灌注约5至10分钟，去除血液直至澄清，肝脏显示灰白）
2． 使用适量的（30毫升）4℃预冷的HPBIO硫化液（Reagent A）灌注处理（建议：至少10分钟，肝脏显示发黑）
3． 使用适量的（30毫升）4℃预冷的HPBIO固着液（Reagent B）灌注处理
4． 即刻小心取出脑组织（组织显示蓝灰色调）
5． 小心放进20毫升HPBIO固着液（Reagent B）里
6． 置于4℃冰箱里浸泡孵育60分钟
7． 转移到20毫升HPBIO硫化液（Reagent A）里
8． 置于4℃冰箱里浸泡孵育30分钟
9． 即刻用无菌镊子夹起组织块 
10． 放进用户自备的无离子水清洗2分钟
11． 用绵纸吸干组织快
12． 即刻进行常规4℃冰箱里30%蔗糖脱水过夜和OCT处理后包埋
13． 在－20℃条件下进行缓慢冰冻切片，为30微米厚，并铺片在明胶化载玻片上
14． 置于－20℃冰箱里保存
 
二、 样本染色处理
 
染色开始前，取出HPBIO染色液A（Reagent D）置于室温下预热，然后移取1毫升HPBIO染色液A（Reagent D）到1.5毫升离心管，加入15微升HPBIO染色液B（Reagent E），混匀后，标记为HPBIO染色工作液，置于暗室里备用。然后进行下列操作
 
1． 取出10片待测的30微米厚的冰冻组织切片
2． 小心加上200微升HPBIO清理液（Reagent C）铺满整个切片样品表面
3． 小心移去切片上的HPBIO清理液（Reagent C）
4． 小心加上200微升HPBIO染色工作液，铺满整个切片样品表面
5． 26℃温度下孵育50分钟，避免光照
6． 小心移去切片上的HPBIO染色工作液
7． 室温下，小心将切片置入50毫升HPBIO清理液（Reagent C）中孵育10分钟
8． 小心移去切片上的HPBIO清理液（Reagent C）
9． （选择步骤）进行复染操作（建议使用HPBIO甲苯酚紫（CRESYL VIOLET）复染试剂盒 或HPBIO中性红复染试剂盒 ）
10． 透明处理
11． 放上盖玻片或封片（中性树脂）
12． 即刻在一般光学显微镜下观察：含锌神经细胞体，例如锥体细胞、齿状颗粒细胞、突触泡囊等，呈现黑色（如果复染――细胞核呈现蓝色，胞浆尼氏（体）物质呈现粉红至紫色）
13． 齿状回内分子层苔藓纤维出芽（mossy fiber sprouting）评分

评分	特征
0	未见颗粒
1	偶见颗粒
2	较多颗粒，不连续分布
3	较多颗粒
4	较多颗粒，连续分布
5	颗粒致密成层状带

 
14． 其它结构区域染色评分

评分	特征
0	染色阴性
1	染色很浅
2	染色较浅
3	中等染色
4	致密较深染色