细胞色素P450亚酶1A2，简称为CYP1A2，是肝细胞微粒体复合功能氧化酶系统的成员之一，也是芳香族碳氢化合物加羟基酶（aryl hydrocarbon hydrorylase；AHH）的成员之一。在人体肝脏里占P450酶系15％。与CYP1A1高度同源，特别是在外显子2、4、5和6。CYP1A2由多个多态性变体，最常见的是：1A和1F，与咖啡因代谢和迟发性皮肤卟啉症（porphyria cutanea tarda）相关。CYP1A2的作用在于体内外源化合物

（xenobiotics），包括药物、致癌剂、化学污染物的氧化代谢，即单加氧化作用（monooxygenation）和羟化
作用（hydroxylation）,以及脂类合成包括胆固醇和类固醇。芳香族碳氢化合物诱导CYP1A2的表达。甲氧基异酚噁唑脱甲基酶（7-methoxyresorufin-O-demethylase；MROD）的活性是细胞色素P450亚酶1A2的诊断标记，其基于MROD选择性催化细胞色素P450亚酶1A2的活性。甲氧基异酚噁唑（7-methoxyresorufin）在甲氧基异酚噁唑脱甲基酶的催化下，转化为羟基异吩噁唑酮（resorufin）后荧光峰值的变化（激发波长530nm， 散发波长590nm），来定量测定细胞色素P450亚酶1A2的活性。甲氧基异酚噁唑脱甲基酶反应系统为：
 
 
 

产品内容

 
HEPENGBIO 缓冲液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO 反应液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO 底物液（Reagent C） 微升
HEPENGBIO 标准液（Reagent D） 微升
产品说明书 1 份
 

保存方式

 
保存在－20℃冰箱里，HEPENGBIO 底物液（Reagent C）和 HEPENGBIO 标准液（Reagent D）避免光照， 有效保证 6 月
 

用户自备

 
1.5 毫升离心管：用于标准样品操作的容器恒温水槽：用于孵育反应
比色皿或黑色 96 孔板：用于反应和荧光分析的容器荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析
 

实验步骤

 
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。一、 测定准备
1. 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或微粒体样品等），置于冰槽里
2. 设定好荧光分光光度仪（温度为 37℃）：激发波长 530nm，散发波长 590nm，并置零
3. 准备好 5 个 1.5 毫升离心管，标记为 1 至 5 号管
4. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 缓冲液（Reagent A）到 1 号管
5. 分别加入 xx 微升 HEPENGBIO 缓冲液（Reagent A）到 2 至 5 号管
6. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 标准液（Reagent D）到 1 号管，混匀
7. 小心移取 xx 微升 1 号管稀释的 HEPENGBIO 标准液（Reagent D）到 2 号管，混匀
8. 小心移取 xx 微升 2 号管稀释的 HEPENGBIO 标准液（Reagent D）到 3 号管，混匀
9. 小心移取 xx 微升 3 号管稀释的 HEPENGBIO 标准液（Reagent D）到 4 号管，混匀
10. 将 1 至 5 号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
 

管号	HEPENGBIO 缓冲液（Reagent A）	HEPENGBIO 标准液（Reagent D）	标准羟基异吩噁唑酮浓度
1	xx 微升	xx 微升	xx 纳摩尔/升
2	xx 微升	xx 微升 1 号管	xx 纳摩尔/升
3	xx 微升	xx 微升 2 号管	xx 纳摩尔/升
4	xx 微升	xx 微升 3 号管	xx 纳摩尔/升
5	xx 微升	0	0

 

二、 标准曲线测定

 
 
1. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 反应液（Reagent B）
3. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent C）
4. 加入 100 微升上述配制的标准液
5. 上下倾倒数次，混匀
6. 在 37℃温度下孵育 10 分钟
7. 即刻放进荧光分光光度仪检测获得相对荧光单位
8. 重复实验步骤 1 至 7 四次
9. 构建标准曲线：纵座标（Y 轴）为相对荧光单位；横座标（X 轴）为标准羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升）

三、 样品测定

 
 
1. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 反应液（Reagent B）
3. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent C）
4. 加入 100 微升待测样品（20 微克微粒体蛋白或 100 微克细胞裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）
5. 上下倾倒数次，混匀
6. 在 37℃温度下孵育 10 分钟
7. 即刻放进荧光分光光度仪检测：获得相对荧光单位
8. 根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升） 四、 计算样品活性
 

五、 荧光酶标仪测定

 
 
1. 在黑色 96 孔板上做好相应标记：标准样品和待测样品
2. 分别移取 xx 微升 HEPENGBIO 缓冲液（Reagent A）到相应孔里
3. 分别加入 xx 微升 HEPENGBIO 反应液（Reagent B）
4. 分别加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent C）
5. 分别加入 25 微升上述配制的标准液或待测样品（20 微克微粒体蛋白或 100 微克细胞裂解萃取液蛋白）
（注意：样品须清澈）
6. 轻轻摇动黑色 96 孔板
7. 在 37℃温度下孵育 10 分钟
8. 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光单位
9. 构建标准曲线：纵座标（Y 轴）为相对荧光单位；横座标（X 轴）为标准羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升）
10. 根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升）
11. 活性计算：
 
 

注意事项

 
1. 本产品为 25 次（比色皿）或 85 次（黑色 96 孔板）操作，包括标准液
2. 操作时，须戴手套
3. 系统操作过程中，标准液测定只需 1 次
4. 样 品 须 澄 清 ， 至 关 重 要 （ 本 公 司 提 供 HEPENGBIO 细 胞 可 溶 性 总 蛋 白 质 制 备 试 剂 盒
HEPENGBIO30002.1）
5. 荧光检测易受到蛋白的干扰，例如牛血清白蛋白（bovine serum albumin；BSA）会与羟基异吩噁唑酮
（resorufin）结合，导致荧光读数的降低
6. 如果样品读数低于背景读数明显，建议使用失活的样品作为样品背景对照，以及标准样品测定
7. 孵育反应完成后即刻进行荧光测定
8. 如果酶活性过低，可以增加反应时间至 30 分钟
9. 荧光测定后，比色皿须清洗彻底